CRISPR-Cas9

O CRISPR-Cas9 é uma ferramenta de edição genética baseada em um sistema de defesa natural que as bactérias usam contra vírus, os bacteriófagos. Quando sobrevive a uma infecção, a bactéria guarda um pedaço do DNA do vírus no próprio genoma, entre sequências repetidas — as “repetições palindrômicas curtas, agrupadas e regularmente espaçadas” que dão nome ao CRISPR (sigla em inglês). Se o mesmo vírus voltar, a bactéria produz um RNA a partir dessa memória, e esse RNA guia a enzima Cas9 até o DNA do invasor, que é cortado e inativado.

Os cientistas “sequestraram” esse mecanismo e o adaptaram para funcionar em praticamente qualquer célula. O resultado é uma ferramenta capaz de cortar o DNA em locais específicos, de forma programável: para mudar o alvo, basta trocar o RNA guia.

Para que serve?

Como funciona?

Um RNA guia, desenhado em laboratório, conduz a enzima Cas9 até um trecho específico do DNA. Ali, a Cas9 faz um corte nas duas fitas da dupla hélice. A célula percebe o dano e tenta repará-lo — e é durante esse reparo que os cientistas conseguem inserir, remover ou alterar trechos do DNA.

As duas peças centrais

Nas bactérias, a função do RNA guia é dividida entre duas moléculas, o crRNA e o tracrRNA. Em 2012, Emmanuelle Charpentier, Jennifer Doudna e colegas mostraram que as duas podiam ser unidas em uma só, o que tornou o sistema muito mais fácil de usar.

Passo a passo

1. Inserção na célula

Primeiro, é preciso levar as peças do CRISPR para dentro da célula. Elas podem entrar na forma de DNA (com as instruções para a célula fabricar a Cas9 e o RNA guia), de RNA ou já montadas, como um complexo pronto de proteína e RNA. Para atravessar a membrana, usam-se métodos químicos, físicos ou virais:

• Lipofecção (químico) — o material é envolvido em pequenas bolhas de lipídios, que se fundem à membrana da célula.
• Eletroporação (físico) — pulsos elétricos abrem poros temporários na membrana.
• Microinjeção (físico) — uma agulha finíssima injeta o material diretamente na célula.
• Transdução (viral) — um vírus modificado, incapaz de causar doença, entrega o material genético.

2. Reconhecimento do DNA-alvo

Dentro do núcleo, o complexo Cas9 + RNA guia percorre o DNA à procura de uma sequência curta chamada PAM (do inglês protospacer adjacent motif). Para a Cas9 mais usada, que vem da bactéria Streptococcus pyogenes, a PAM é NGG: qualquer letra (N) seguida de duas guaninas. Sem uma PAM ao lado, a Cas9 não corta. Nas bactérias, é isso que impede a enzima de cortar o próprio genoma, onde as memórias dos vírus ficam guardadas sem PAM.

3. Pareamento por complementaridade

Ao encontrar uma PAM, a Cas9 abre a dupla hélice logo ao lado. Se as letras do RNA guia forem complementares às do DNA naquele ponto — seguindo as regras de pareamento das bases, A com T e C com G —, o RNA guia se encaixa em uma das fitas.

4. Corte do DNA

Com o RNA guia pareado, a Cas9 corta. Ela tem dois domínios catalíticos, como as duas lâminas de uma tesoura: um deles (HNH) corta a fita que está pareada com o RNA guia, e o outro (RuvC) corta a fita oposta. O resultado é uma quebra nas duas fitas, a cerca de três letras da PAM.

A Cas9 corta, a célula edita

A Cas9 é só a tesoura. Quem edita de fato é a própria célula, ao consertar o corte. Para isso, ela tem dois caminhos principais:

Junção de extremidades não homólogas

A célula simplesmente cola as duas pontas. É rápido, mas impreciso: muitas vezes algumas letras são perdidas ou acrescentadas no ponto do corte (inserções e deleções). Se isso acontece no meio de um gene, a receita fica ilegível e o gene deixa de funcionar — é o chamado knockout, ou nocaute.

Recombinação homóloga

Se os cientistas fornecem, junto com o CRISPR, um molde de DNA parecido com a região do corte e contendo a alteração desejada, a célula pode usá-lo para fazer o conserto, em um “copiar e colar”. É mais preciso e serve para corrigir mutações, inserir genes ou fazer edições pontuais. Por outro lado, acontece com menos frequência e funciona melhor em células que estão se dividindo.

Por que o CRISPR é tão revolucionário?

Já era possível editar genes antes, mas as técnicas anteriores eram caras, demoradas e pouco precisas: para cada novo alvo, era preciso fabricar uma proteína diferente. Com o CRISPR, a proteína é sempre a mesma — muda só o RNA guia, que é barato e rápido de produzir. Isso tornou a edição genética acessível a laboratórios do mundo todo e aplicável a praticamente qualquer organismo, de bactérias a plantas, animais e células humanas.

As aplicações vão da pesquisa básica ao tratamento de doenças genéticas, passando por culturas agrícolas mais resistentes e pela biotecnologia. Em 2020, Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna receberam o Prêmio Nobel de Química pelo desenvolvimento do método. Em 2023, foi aprovado nos Estados Unidos e no Reino Unido o primeiro tratamento baseado em CRISPR-Cas9, para a doença falciforme.

Ilustrações criadas com BioRender.com.