Sequenciamento de DNA

Sequenciar o DNA é descobrir a ordem das suas letras — as bases adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). É essa ordem que guarda a informação genética: onde estão os genes, quais trechos controlam quando eles são ligados e quais alterações podem causar doenças.

O genoma humano tem cerca de 3 bilhões de pares de bases. A primeira leitura dele, feita pelo Projeto Genoma Humano, levou 13 anos e foi concluída em 2003. Hoje, um genoma inteiro pode ser sequenciado em poucos dias, por alguns milhares de dólares ou menos.

Como se lê uma molécula tão pequena?

Nenhuma máquina enxerga as letras do DNA diretamente. A maioria dos métodos usa a mesma estratégia: copiar o DNA com a enzima DNA polimerase — a mesma que a célula usa para duplicar o seu material genético — e registrar qual letra entra a cada passo.

Isso funciona porque as bases sempre pareiam do mesmo jeito: A com T, e C com G. Sabendo qual letra foi adicionada à cópia, sabe-se qual estava no molde.

Os diferentes tipos

Sanger: o método clássico

Criado pelo bioquímico britânico Frederick Sanger em 1977, o método usa versões modificadas das letras que interrompem a cópia quando são incorporadas. Assim, cada cópia termina em um ponto diferente — e a última letra de cada uma revela a sequência, posição por posição. Na versão usada hoje, tudo acontece em um só tubo:

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O primer se liga ao DNA molde, e a DNA polimerase começa a copiar, adicionando nucleotídeos complementares.

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De vez em quando, entra um terminador (ddNTP) no lugar de um nucleotídeo comum. Falta a ele o grupo químico onde o próximo nucleotídeo se ligaria, e a cópia para ali.

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O resultado é uma mistura de cópias de todos os tamanhos, cada uma terminando em uma letra marcada com uma cor.

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As cópias correm por um tubo finíssimo cheio de gel (eletroforese capilar): as menores andam mais rápido. Um laser faz cada cor brilhar ao passar pelo detector.

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Um programa transforma a ordem das cores em letras. O gráfico de picos coloridos é o cromatograma.

O método lê trechos de até cerca de mil letras por vez, com altíssima precisão. Foi a base do Projeto Genoma Humano e ainda é muito usado para confirmar mutações e conferir trechos curtos. A técnica rendeu a Sanger seu segundo Prêmio Nobel de Química, em 1980.

Nova geração: milhões de leituras ao mesmo tempo

A partir de meados dos anos 2000, surgiram os sequenciadores de nova geração (NGS, do inglês next-generation sequencing). Neles, o DNA é quebrado em milhões de fragmentos curtos — em geral de 100 a 300 letras —, que são lidos todos ao mesmo tempo. Na técnica mais difundida, cada letra incorporada à cópia emite uma luz de cor diferente, registrada por uma câmera a cada ciclo. É o chamado sequenciamento por síntese.

Como cada fragmento é curto, um programa de computador precisa depois montar o quebra-cabeça: alinhar as leituras que se sobrepõem ou compará-las com um genoma de referência. Ler tudo em paralelo foi o que fez o custo do sequenciamento despencar.

Leituras longas: uma molécula de cada vez

As tecnologias mais recentes, chamadas de terceira geração, leem moléculas únicas de DNA com dezenas de milhares de letras (ou mais) de uma só vez. No sequenciamento por nanoporos, uma fita de DNA atravessa um poro minúsculo em uma membrana, e cada letra altera de um jeito característico a corrente elétrica que passa por ele. Em outra abordagem, uma câmera observa uma única DNA polimerase copiando o DNA, com cada letra marcada por uma cor.

Leituras longas ajudam a decifrar regiões muito repetitivas do genoma, que leituras curtas não conseguem montar. Foi combinando essas tecnologias que, em 2022, o genoma humano foi finalmente lido de ponta a ponta, sem lacunas.

O que sequenciar?

Nem sempre é preciso ler o genoma inteiro. Dependendo da pergunta, os cientistas escolhem o que sequenciar:

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