Como funciona o padrão ouro usado para a detecção do vírus da COVID-19

A RT-qPCR é uma técnica que permite detectar e quantificar RNA.

Ela combina duas etapas. Primeiro, a transcrição reversa (RT) converte o RNA em DNA complementar, o cDNA, porque a PCR só consegue copiar DNA. Depois, a PCR quantitativa (qPCR) multiplica esse cDNA e acompanha, ciclo a ciclo, um sinal fluorescente que cresce junto com as cópias. Quanto mais RNA havia na amostra, mais cedo esse sinal aparece — e é isso que permite medir a quantidade inicial.

Por que medir RNA?

QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

A RT-qPCR permite medir quanto um gene está sendo expresso em uma célula ou tecido. Ao quantificar o RNA produzido, é possível comparar a atividade gênica entre diferentes condições, como células saudáveis e doentes ou antes e depois de um tratamento.

VALIDAÇÃO DE RNAi (SILENCIAMENTO GÊNICO)

Quando um gene é silenciado por RNAi, a RT-qPCR é usada para verificar se isso realmente aconteceu. A técnica mede a quantidade de RNA do gene alvo: se os níveis diminuem, isso indica que o silenciamento foi eficaz, ou seja, que a atividade do gene foi reduzida.

DETECÇÃO DE AGENTES PATOGÊNICOS

A RT-qPCR é amplamente utilizada no diagnóstico de doenças infecciosas, especialmente aquelas causadas por vírus de RNA, como SARS-CoV-2 (causador da COVID-19). Ela detecta o material genético do patógeno na amostra, permitindo identificar infecções e, em muitos casos, estimar a carga viral.

DETECÇÃO DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

A PCR em tempo real é usada para verificar se alimentos, rações e sementes contêm organismos geneticamente modificados (OGMs) — e em que proporção. O teste procura trechos de DNA que foram inseridos na planta, como o promotor 35S, comum a muitas variedades transgênicas. Já a RT-qPCR, que parte do RNA, mostra se o gene inserido está de fato ativo na planta.

Como funciona a RT-qPCR?

A RT-qPCR recebe esse nome porque ocorre em duas fases: primeiro a transcrição reversa (RT) e, em seguida, a PCR quantitativa (qPCR).

Primeiro o RNA é convertido em DNA complementar (transcrição reversa). Depois o DNA é amplificado em tempo real, enquanto um sinal fluorescente permite quantificar o material à medida que ele é produzido.

O processo pode ser dividido em etapas:

1. Extração do RNA

Tudo começa com a extração do RNA de células ou tecidos.
Esse RNA representa os genes que estavam ativos naquele momento.

2. Transcrição reversa (RT)

O RNA é convertido em DNA complementar (cDNA) por uma enzima chamada transcriptase reversa.

Transcriptase reversa

É uma enzima que usa o RNA como molde para sintetizar uma fita complementar de DNA. Nesse processo, forma-se inicialmente uma molécula híbrida de DNA/RNA, que depois dá origem ao cDNA de fita dupla.

3. qPCR (PCR QUANTITATIVA)

O cDNA entra na reação de PCR junto com:

• Primers (iniciadores específicos do gene)
• Uma molécula fluorescente

A cada ciclo:

• O DNA é amplificado (copiado)
• A fluorescência aumenta

Um equipamento mede essa luz em tempo real, permitindo acompanhar a amplificação.

4. Quantificação

O ponto-chave da análise é o Ct (Cycle threshold) — o ciclo em que a fluorescência ultrapassa um nível detectável.

• Ct baixo → havia muito RNA inicial → gene mais ativo
• Ct alto → havia pouco RNA → gene menos ativo

Ou seja, quanto mais cedo o sinal aparece, maior era a quantidade inicial de RNA.

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